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Mutagenesi ed evoluzione di ceppi ed enzimi

Quando il limite di un processo è il ceppo o l’enzima, cambiare le condizioni intorno prima o poi smette di servire. La mutagenesi cambia il catalizzatore stesso — in modo casuale, razionale o entrambi — e lo screening che ci sta dietro decide se troverai la variante che conta.

Parliamo del tuo enzima

PERCHÉ MUTARE

Che cosa si chiede alla mutagenesi

Ci occupiamo di ingegneria genetica e modificazione di microrganismi ed enzimi per migliorarne attività e proprietà. Questi sono i tre colli di bottiglia per cui di solito viene chiamata in causa.

Una resa che non si muove

La biotrasformazione funziona e il numero resta dov’è. Le condizioni di processo hanno un tetto: a sollevarlo è una variante migliore.

Un’attività secondaria o un’inibizione

Un sottoprodotto che ti costa a valle, oppure un substrato o un prodotto che spengono la reazione prima che il carico diventi economico. Sono entrambe proprietà del catalizzatore, ed entrambe si possono ingegnerizzare.

Prestazione nelle tue condizioni

Temperatura, pH, solvente o matrice per cui il wild type non è mai stato selezionato. La selezione si fa nelle condizioni in cui il processo lavora davvero, non in quelle che preferisce l’enzima.

Come si svolge un progetto

Tre fasi, ciascuna che si chiude con una decisione e non con un report. Quanto dura ciascuna dipende da quanto la proprietà obiettivo è misurabile: la dimensioniamo dopo il primo confronto, non prima.

Fase uno

Proof of concept

La proprietà obiettivo viene definita e, soprattutto, resa misurabile. Costruiamo prima il saggio di screening — una lettura ad alta processività che correli con ciò che serve al processo — perché una libreria vale sempre e solo quanto lo screening che ci sta dietro.

Fase due

Ottimizzazione

Mutagenesi casuale dove la relazione struttura–funzione non è chiara, disegno razionale guidato da strumenti bioinformatici dove lo è, e di solito entrambi in sequenza. Si vagliano in parallelo grandi numeri di mutanti e i candidati vengono rimisurati sulla stessa base analitica prima di essere chiamati tali.

Fase tre

Industrializzazione

Le varianti migliori vengono prodotte in scala, caratterizzate come si deve e provate nel processo reale invece che nel formato di screening. Stabilità genetica e riproducibilità si verificano prima che una variante diventi quella da cui dipendi.

Che cosa misuriamo

Un enzima migliore resta un’affermazione finché lo stesso saggio non lo dice due volte. Questi sono gli endpoint che riportiamo.

Attività — unità per milligrammo rispetto al parentale, con lo stesso saggio
Selettività — regio-, stereo- e chemoselettività, e i sottoprodotti eliminati o creati
Inibizione da substrato e da prodotto — il tetto al carico prima e dopo
Finestra operativa — tolleranza a temperatura, pH e solvente della variante rispetto al parentale

Stabilità — attività mantenuta nel tempo e nei cicli, in condizioni di processo
Espressione — perché un enzima migliore che si esprime male non è un processo migliore
Stabilità genetica — il miglioramento mantenuto nelle generazioni, non misurato una volta sola su una vial fresca
Prestazione nel processo reale — il numero che decide, misurato fuori dal formato di screening

Il laboratorio dietro tutto questo

Dotazione

Biologia molecolare	Estrazione, PCR e qPCR, clonaggio e costruzione di vettori, verifica di sequenza e sequenziamento, anche fino al genoma completo
Colture	Beute e deep-well per lo screening, bioreattori da banco; colture di cellule CHO, dai formati di screening fino alla scala da 100 litri
Conservazione	Crioconservazione e storage a −80 °C, con controlli di identità, vitalità e purezza su ogni banca
Analitica	SDS-PAGE, SEC, Bradford, HPLC e UPLC, saggi di attività secondo il target

Che cosa porti a casa

Variante	Il ceppo o l’enzima migliorato, caratterizzato e con le prestazioni documentate
Dossier	Dati, condizioni provate e risultati, nella forma che serve al tuo fascicolo tecnico
Lotto pilota	Produzione in scala quando il progetto arriva a quel punto

Partiamo dal collo di bottiglia

Raccontaci quale proprietà oggi limita il processo e come viene misurata. Ti diremo se la mutagenesi è la strada giusta e come sarebbe la prima fase.