Espressione eterologa di proteine
Una proteina che si esprime non è la stessa cosa di una proteina che puoi produrre. Lo sviluppo dell’espressione è scegliere ospite, costrutto e condizioni che ti danno una proteina attiva nella quantità che il processo richiede, e che continuano a funzionare quando il volume cresce.
Parliamo della tua proteinaLa prima decisione è l’ospite
Sulla base delle caratteristiche della proteina e di ciò che ti serve, sviluppiamo il vettore e il ceppo ricombinante e individuiamo il sistema di espressione adatto all’applicazione. La fattibilità la facciamo su più ospiti in parallelo, invece di difenderne uno preferito.
E. coli
Il sistema più usato e più economico per ottenere una proteina eterologa, ed è il primo tentativo giusto per la maggior parte dei target. Prima una fattibilità rapida ed economica su quantità da ricerca, per screening di attività e selettività, poi scale-up e trasferimento tecnologico quando la proteina si comporta bene.
Lieviti e funghi
Pichia pastoris, Aspergillus e Yarrowia, quando la proteina richiede secrezione, glicosilazione o un ambiente di ripiegamento che un batterio non può offrire. Con le tecnologie che usiamo è anche possibile sviluppare ceppi che esprimono senza induttori costosi e difficilmente scalabili come il metanolo per Pichia.
È la proteina a decidere
Dimensione, ponti disolfuro, secrezione, modificazioni post-traduzionali e tossicità per l’ospite portano a risposte diverse. Per questo la fattibilità corre in parallelo su più ospiti e la scelta si fa sui dati.
Come si svolge un progetto
Tre fasi, ciascuna che si chiude con una decisione e non con un report. Quanto dura ciascuna dipende dalla proteina: la dimensioniamo dopo il primo confronto, non prima.
Proof of concept
Progettazione e costruzione del vettore, trasformazione, prime prove di espressione e le tre domande che contano: la proteina c’è, è solubile, è attiva? Fattibilità su uno o più ospiti, con una risposta onesta anche quando è no.
Ottimizzazione
Promotore e strategia di induzione, uso dei codoni, peptide segnale e secrezione, terreno, temperatura e condizioni di induzione. Miglioramento del ceppo dove il limite è l’ospite, e una prima purificazione perché attiva sia misurato su proteina che si può davvero vedere.
Industrializzazione
Condizioni di fermentazione e purificazione spostate verso la produzione, resa per litro, stabilità del ceppo ricombinante e il pacchetto di trasferimento tecnologico che permette al processo di girare altrove.
Che cosa misuriamo
L’espressione è facile da dichiarare su un gel. Questi sono gli endpoint che riportiamo.
- Livello di espressione — proteina per litro e per grammo di biomassa, con il metodo dichiarato
- Frazione solubile — quanto è proteina utilizzabile e quanto è corpo di inclusione
- Attività specifica — unità per milligrammo, perché espressa non vuol dire attiva
- Efficienza di secrezione — dove l’ospite secerne, quanto arriva davvero nel terreno
- Stabilità del ceppo — espressione mantenuta nelle generazioni, e senza pressione selettiva dove il processo lo richiede
- Comportamento in purificazione — come si comporta la proteina nei primi step di downstream, che spesso decide l’ospite
- Riproducibilità — lo stesso costrutto e le stesse condizioni ripetuti, con la dispersione dichiarata
- Comportamento in scala — che cosa cambia tra beuta, banco e 100 litri
Il laboratorio dietro tutto questo
Dotazione
| Biologia molecolare | Estrazione, PCR e qPCR, clonaggio e costruzione di vettori, verifica di sequenza e sequenziamento, anche fino al genoma completo |
| Colture | Beute e deep-well per lo screening, bioreattori da banco; colture di cellule CHO, dai formati di screening fino alla scala da 100 litri |
| Conservazione | Crioconservazione e storage a −80 °C, con controlli di identità, vitalità e purezza su ogni banca |
| Analitica | SDS-PAGE, SEC, Bradford, HPLC e UPLC, saggi di attività secondo il target |
Che cosa porti a casa
| Ceppo e costrutto | Il ceppo ricombinante e il suo vettore, caratterizzati e con l’espressione documentata |
| Dossier | Dati, condizioni provate e risultati, nella forma che serve al tuo fascicolo tecnico |
| Lotto pilota | Produzione in scala quando il progetto arriva a quel punto |
Partiamo dalla proteina
Raccontaci la sequenza, che cosa deve fare la proteina e la quantità che ti serve. Ti diremo quale ospite vale la pena provare per primo e come sarebbe la fattibilità.
Parliamo della tua proteina